倒置熒光顯微鏡如何觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白|應(yīng)用百科

倒置熒光顯微鏡搭配熒光蛋白能可視化觀察活細(xì)胞的細(xì)胞器，而想達(dá)到更精細(xì)的特定目標(biāo)細(xì)胞或特定部分進(jìn)行標(biāo)記示蹤，則需要用到光激活、光轉(zhuǎn)化或光控開關(guān)熒光蛋白，一般這需要共聚焦顯微鏡或者超分辨顯微鏡，但也有方法可以用普通的倒置熒光顯微鏡（寬場(chǎng)熒光）觀察，今天我們就來(lái)跟大家介紹一下。

光轉(zhuǎn)化熒光蛋白mEos2轉(zhuǎn)化觀察

·光轉(zhuǎn)化熒光蛋白

光轉(zhuǎn)化熒光蛋白Kaede有兩個(gè)激發(fā)峰，兩個(gè)發(fā)射峰

光轉(zhuǎn)化熒光蛋白是超分辨成像常用的染料，以Kaede為例，在激發(fā)光照射下，會(huì)發(fā)出綠色熒光，而用紫外照射后，會(huì)不可逆地轉(zhuǎn)化為紅色熒光。這種特性可以讓研究人員界定特定的細(xì)胞，或細(xì)胞的特定部分，作為ROI。

光轉(zhuǎn)化熒光蛋白多來(lái)自珊瑚

這種綠紅轉(zhuǎn)化的熒光蛋白來(lái)自珊瑚，因其轉(zhuǎn)化跟秋天的楓葉從綠變紅相似，故而得名Kaede（楓葉），但由于性質(zhì)限制，Kaede并不是可靠易用的商用活細(xì)胞染色劑。在超分辨成像中常用的光轉(zhuǎn)化熒光蛋白主要有Dendra2、mEos2、和mKikGR三種。

Dendra2熒光光譜更符合常規(guī)激發(fā)塊設(shè)計(jì)

·為什么用寬場(chǎng)熒光顯微鏡？

研究級(jí)倒置熒光顯微鏡MF53-N（寬場(chǎng)熒光）

一般的熒光顯微鏡都是寬場(chǎng)熒光顯微鏡，相比共聚焦顯微鏡，它的Z軸分辨率沒(méi)有那么高，高倍放大下成像會(huì)有焦外激發(fā)形成的光暈，無(wú)法獲得邊緣非常銳利的熒光成像。

但熒光顯微鏡觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白有幾個(gè)好處，首先熒光顯微鏡的儀器成本要比共聚焦低得多，而且相對(duì)簡(jiǎn)便易用，是相對(duì)更普及的儀器設(shè)備。

長(zhǎng)通U激發(fā)下的蕨葉，可見多色熒光

此外，共聚焦顯微鏡為了追求精度，通常無(wú)法在操作光轉(zhuǎn)化的同時(shí)觀察轉(zhuǎn)化情況。而熒光顯微鏡的U紫外激發(fā)塊配置，很多用的是LP長(zhǎng)通發(fā)射濾光片，可以同時(shí)顯示藍(lán)色發(fā)射到紅色發(fā)射，可以在操作光轉(zhuǎn)化同時(shí)觀察轉(zhuǎn)化情況。

·熒光顯微鏡如何觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白

研究級(jí)熒光顯微鏡MF43-N

熒光顯微鏡想要觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白，先決條件是有多色激發(fā)塊配置，并且熒光光路有視場(chǎng)光闌，用長(zhǎng)通配置的U激發(fā)塊（DAPI激發(fā)塊），這可能需要研究級(jí)的熒光顯微鏡。

Connexin43-Dendra2揭示縫隙連接蛋白Cx動(dòng)態(tài)

轉(zhuǎn)化前的成像和準(zhǔn)備：

1、關(guān)燈準(zhǔn)備暗室成像，讓眼睛適應(yīng)暗室。

2、切換激發(fā)塊到藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)。

3、LED熒光光源把亮度調(diào)低，然后關(guān)掉；汞燈光源請(qǐng)插入ND濾光鏡。關(guān)閉激發(fā)光擋板（如有）。

4、轉(zhuǎn)換為100X油浸物鏡或其他高倍物鏡，油鏡加油。

5、放置準(zhǔn)備好的樣品。

6、使用相襯觀察，對(duì)焦到細(xì)胞上，把轉(zhuǎn)化目標(biāo)移到視野中間。

7、LED熒光光源打開激發(fā)光；汞燈光源打開激發(fā)光擋板（如有）；

8、調(diào)節(jié)到合適參數(shù)，拍照，獲得轉(zhuǎn)化處理前綠色熒光圖像。

9、切換激發(fā)塊到綠色激發(fā)波長(zhǎng)，調(diào)節(jié)參數(shù)拍攝紅色熒光圖像。通常沒(méi)有或少量紅色熒光。

Dendra2-H2B揭示組蛋白H2B非常穩(wěn)定

操作觀察轉(zhuǎn)化熒光蛋白和成像：

1、相襯觀察，確認(rèn)目標(biāo)在視野中間。

2、收小熒光光路的視場(chǎng)光闌，以將熒光照射范圍縮小到視野中間。

3、切換激發(fā)塊到紫外波長(zhǎng)，調(diào)高LED熒光光源亮度，汞燈要拔出ND減光鏡。可以在目鏡下看到綠色熒光向紅色熒光轉(zhuǎn)化，可以調(diào)節(jié)熒光光路的視場(chǎng)光闌控制轉(zhuǎn)化區(qū)域大小，轉(zhuǎn)化時(shí)間可能耗時(shí)5-10秒，視乎紫外光源的強(qiáng)度。

4、切換到B激發(fā)塊，打開熒光光路視場(chǎng)光闌，拍攝綠色熒光，切換到G激發(fā)塊拍攝紅色熒光，現(xiàn)在應(yīng)該可以看到明顯的紅色熒光。

5、設(shè)定時(shí)間間隔，拍攝綠色和紅色熒光，即可對(duì)特定細(xì)胞或者蛋白的變化進(jìn)行研究了。

Dendra2-α-tubulin示蹤微管蛋白動(dòng)態(tài)聚合和分離

利用這套工作流，你還可以觀察光激活蛋白、FRET熒光共振能量轉(zhuǎn)移、光控開關(guān)熒光蛋白，對(duì)于一些比較宏觀的教學(xué)和研究都非常方便。